اختراع کیت تشخیص طبی - آزمایشگاهی نمونه های خونی سپسیس براساس مدل مولکولی برو کلسیتونین

سپسیس در اثر عفونتهای باکتریال ایجاد می گردد و موجب اختلال حاد در عملکرد ارگانهای حیاتی می گردد که با درمان به موقع و مناسب با آنتی بیوتیکها میتوان نتایج درمانی بهتری را انتظار داشت. مهمترین عامل در کاهش مرگ و میر ناشی از سپسیس و ناتوانی های دوران بعدی، درمان مناسب و سریع است، در حالی که، تشخیص قطعی سپسیس با کشت باکتریایی انجام می شود که در این روش تشخیصی صرف زمان طولانی و حیاتی مشکل آفرین خواهد بود؛ از سوی دیگر علایم بالینی بیمار برای تشخیص قطعی سپسیس حساسیت کافی ندارند و نیز یافته های آزمایشگاهی شامل شمارش سلول های خونی و تستهای ایمونولوژی نیز در مقایسه با کشت خون، حساسیت و ویژگی کمتری دارند؛ بنابراین تستهای آزمایشگاهی که التهاب غیر عفونی و سپسیس را افتراق دهند بسیارمفید هستند. به همین دلیل مطالعات زیادی در دهه اخیر برای دسترسی به مارکرهایی که بتوان از آنها برای تشخیص زود رس سپسیس استفاده کرد انجام شده است؛ در این میان پروکلسیتونین جایگاه قابل توجهی را به خود اختصاص داده است. پروکلسیتونین(PCT) نوعی پروهورمون کلسیتونین است که به طور طبیعی توسط سلولهای C غده تیرویید تولید می شود و فعالیت هورمونی شناخته شده ای ندارد. پروکلسیتونین در هنگام سپسیس توسط ماکروفاژها و مونوسیتهای ارگانهای مختلف تولید و به داخل جریان خون آزاد می شود. عقیده بر این است که پروکلسیتونین توسط کبد و سلولهای مونونوکلئر خون محیطی تولید و توسط لیپو پلی ساکاریدها و سایتوکینهای در ارتباط با سپسیس تنظیم می شود. بنابراین بررسی پروکلسیتونین یک بررسی حساس با افتراق واضح بین عفونتهای میکروبی و غیر میکروبی است. در ضمن پروکلسیتونین یک مارکر اختصاصی پذیرفته شده برای عفونت باکتریال در بیماران مشکوک به سپسیس و یک راهنمای خوب برای شروع آنتی بیوتیک در بیماران بستری در بخشهای اورژانس به علت عفونت تنفسی می باشد. این پروتئین به عنوان یکی از نشانگرهای باکتریمی و سپسیس نظیر CRP، اینترلوکینها و سیتوکاین ها می دانند. در افراد سالم غلظت PCT پلاسما کمتر از  ng/ml05/0 و در بیماران مبتلا به سپسیس، سپسیس شدید یا شوک عفونی می تواند به ng/ml 1000 افزایش یابد. معمولا غلظت بیش ng/ml 5 پروکلسیتونین غیر طبیعی تلقی شده و می تواند نشان دهنده سپسیس باشد. در مقایسه نتایج آزمایشگاهی با تکنیکPCR ، سنجش پروکلسیتونین حساسیت و اختصاصیت بالاتری برای تشخیص سپسیس در بیماران بد حال دارد. بنابراین این تست حتی به عنوان یک مارکر سریع در تشخیص افتراقی مرگ به دنبال سپسیس از علل غیر سپسیس پذیرفته شده است. مطالعات و گزارشات زیادی در حال حاضر در دسترس می باشد که حاکی از توان فوق العاده آپتامر برای اتصال اختصاصی و متعاقب آن شناسایی دقیق مولکول هدف خود می‌باشد. آپتامر ها که به عنوان آنتی بادی های شیمیایی نیز شناخته می شوند جایگزین بسیار مناسبی برای آنتی بادی ها بوده و با مزایای بیشتر می توانند در مقوله های تشخیصی و درمانی وارد شوند. آپتامر در مقایسه با آنتی بادی دارای مزایای ویژه ای است که از جمله آن می توان به اندازه کوچک آپتامر ها، قدرت نفوذ بالا، هزینه اندک تولید با استفاده از روش سنتز شیمیایی و برون تنی، عدم ایمنوژنیسیته، پایداری بالا در شرایط احیا و دمای بالا، ایجاد تغییر و اصلاحات شیمیایی آسان، اختصاصیت و تمایل هم تراز و یا در بعضی از مواقع بیشتر از آنتی بادی و غیره اشاره نمود. آپتامر ها این توانایی را دارند که به طور اختصاصی و با تمایل بالا و ثابت تفکیک پایین به اهداف بسیار متنوعشان از یک یون گرفته تا یک هدف کاملا پیچیده نظیر یک ارگانیسم کامل متصل گردند. آپتامر ها نیز می توانند تنها یک اپی توپ متفاوت را در مولکول هدف خود تشخیص دهند. در این مطاله هدف ما طراحی و ساخت یک کیت تشخیصی بر پایه آپتامر DNA علیه پروکلسیتونین می‌ باشد که می تواند به طور اختصاصی این پروتئین را شناسایی کرده و در تشخیص سریع باکتریمی مفید واقع شود. ابتدا ژن مربوط به پروکلسیتونین سنتز شد و درون وکتور مناسب کلون و به باکتری ترانسفرم کردیم. باکتری حاوی ژن نوترکیب را در محیط لوریا برتونی با غلظت مناست از IPTG جهت القای بیان ژن کشت شد. پروتئین تولیدی بر روی ژل پلی اکریلامید بررسی و پس از تائید بیان پروتئین، با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی تخلیص و تعیین غلظت گردید. به منظور رسیدن به آپتامر مناسب این مراحل انجام شد: 1- طراحی کتابخانه تصادفی از نوکلئوتیدها که به صورت حضور تصادفی 25 نوکلئوتید در میان دو ناحیه ثابت پرایمری، 2- طراحی پرایمرهای اختصاصی معمولی، بیوتینه و فسفوریله متناسب با نواحی ثابت آپتامر های کتابخانه طراحی شده، 3- به کار گیری روش SELEX (شامل مراحل: Binding- اتصال DNA  موجود در کتابخانه آپتامری به مولکول هدف که در این تحقیق پروکلسیتونین است، Washing، Isolation، PCR و تکرار مراحل تا 10 مرتبه؛ روش اختصاصی SELEX، بکارگیری تکنیک هایی خاص مانند استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی، یا مگنت بید و یا هر هر روش دیگری که برای جداسازی بهینه آپتامر های اختصاصی علیه هدف ما مناسب می باشد. 4- کلونینگ قطعات آپتامری در باکتری E. coli و تعیین ترادف قطعه آپتامری، 5- سنتز آپتامر های منتخب و مقایسه آنها از لحاظ میزان تمایل به هدف و انتخاب بهترین آپتامر، 6- مرحله نهایی نیز بررسی قدرت شناسایی پروکلسیتونین در نمونه های بالینی به کمک آپتامر خواهد بود. در بررسی نتایج کیت طراحی شده، کیت قابلیت تشخیص مقادیر ng/ml 5/1 از مقادیر پروکلسیتونین را نمونه آزمایشگاهی داشته است. در مقایسه نتایج بالینی با سایر شاخص های رایج قابل اندازه گیری در آزمایشگاه (ESR، شمارش WBC، CRP، تعداد پلاکت و همچنین بررسی میزان جزء C3 از کمپلمان)، نتایج حاصل از سنجش کیت در نمونه های بالینی افراد مبتلا به سپسیس حساسیت و اختصاصیت بالایی نشان داد. با توجه به نتایج حاصل آزمایشگاهی در خصوص کیت طراحی شده و انطباق آن با یافته های بالینی و در مقایسه با سایر تست های رایج آزمایشگاهی، می توان این کیت را بعنوان یک تست جدید آزمایشگاهی معرفی نمود.
مشخصات طرح مرتبط:
مجری اصلی: دکتر عباس عبدالهی   |   تاریخ اتمام طرح: ۱۳۹۶/۸/۲۲   |   کد طرح: 94072


CAPTCHA code
کلیدواژه ها: سپسیس | پروکلسیتونین | اینترلوکینها و سیتوکاین ها | DNA |

دفعات مشاهده: 21 بار   |   دفعات چاپ: 5 بار   |   دفعات ارسال به دیگران: 0 بار   |   0 نظر